适用范围

• 规定分枝杆菌（除外麻风分枝杆菌）感染实验诊断的关键技术要求
• 适用于医疗机构临床实验室开展相关实验诊断工作

术语和定义

• 结核分枝杆菌复合群（MTBC）：遗传学高度相关、表型相似，可引起人或动物结核病的分枝杆菌总称，包含结核分枝杆菌、牛分枝杆菌等多个亚型
• 非结核分枝杆菌（NTM）：分枝杆菌属内除MTBC和麻风分枝杆菌以外的其他分枝杆菌
• 慢生长型非结核分枝杆菌（SGM）：固体培养基上培养>7d出现肉眼可见菌落的NTM
• 快生长型非结核分枝杆菌（RGM）：固体培养基上培养≤7d出现肉眼可见菌落的NTM
• 结核病（TB）：MTBC引起的人类疾病，结核分枝杆菌是最主要致病病原体
• 非结核分枝杆菌病（NMD）：机体感染NTM后出现相应临床症状、体征及影像学表现，存在病原学和/或病理学证据
• 一线抗结核药物：用于治疗药物敏感结核病的抗结核药物，包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇
• 二线抗结核药物：用于治疗耐药结核病或对一线药物禁忌、不耐受患者的抗结核药物，包括左氧氟沙星、莫西沙星、贝达喹啉等
• 耐药结核病（DR-TB）：由对至少一种抗结核药物耐药的MTBC菌株引起的结核病
• 耐多药结核病（MDR-TB）：由对利福平和异烟肼均耐药的MTBC菌株引起的结核病
• 核酸扩增试验（NAAT）：体外扩增特定DNA或RNA序列，高灵敏、特异地检测病原体或遗传标记的试验
• 抗微生物药物敏感性试验（AST）：通过分子生物学技术检测耐药突变，或表型方法测定抗微生物药物敏感性的体外试验

生物安全要求

• 检验全过程生物安全遵循WS/T 442要求
• MTBC相关操作要求
  • MTB和牛分枝杆菌传染性强，ID50小于10个细菌，需注意预防实验室感染
  • 标本涂片染色、分离培养、菌种鉴定、AST等检测活动可在BSL-2实验室进行，宜设独立自闭房间，空气定向流动，操作者佩戴医用防护口罩、穿医用隔离衣
  • 未灭活标本、菌株的气溶胶产生操作需在生物安全柜中进行；标本加入等体积5%次氯酸钠作用15min后可在操作台制备涂片
  • 涂片固定优先选加热板，65℃~75℃固定2h或80℃~85℃固定15min，灭活标本可采用火焰固定

标本采集和运送

送检指征

• 肺部感染
  • 可疑肺结核：咳嗽、咳痰≥2周伴或不伴咯血/痰血，或胸部影像学发现疑似结核病灶，送检呼吸道标本行结核病病原学检测
  • 可疑NTM肺病：有结构性肺病或免疫缺陷人群，出现持续/加重的呼吸道症状，影像学有疑似NTM肺病特征，送检呼吸道标本行NTM病原学检测
• 肺外感染
  • 可疑肺外结核：肺外器官感染，抗感染治疗效果不佳，影像学有疑似结核表现，送检对应标本行结核病病原学检测
  • 可疑肺外NMD：免疫缺陷患者出现肺外感染，或手术/外伤部位脓肿/窦道经抗感染、抗结核治疗无效，送检对应标本行NTM病原学检测

常见标本采集要求

• 呼吸道标本
  • 痰：清水漱口后深咳，采集5~10ml深部痰，最少3ml，初诊患者采集即时痰、清晨痰、夜间痰3份标本
  • 诱导痰：清洁口腔后吸入3% NaCl溶液雾化，采集深部咳痰，标注“诱导痰”，气道高反应者慎用
  • 支气管肺泡灌洗液：总灌入量60~100ml，负压吸引回收，总回收量不低于灌入量30%，至少送检5ml
  • 超声支气管镜穿刺标本：穿刺获得标本后立即置于无菌容器送检
• 胃灌洗液：清晨空腹采集5~15ml，尽快送检，适用于无法咳痰的婴幼儿和儿童
• 无菌体液：脑脊液采集至少2ml、宜10ml，其他无菌体液采集至少2ml、宜15ml，无菌操作穿刺采集
• 尿液：推荐采集清晨首次中段尿，至少10ml、宜40ml，培养需连续3天采集送检
• 粪便：采集新鲜标本至少1g送检
• 脓液和伤口分泌物：不推荐拭子采样，若使用需置于无菌生理盐水中；封闭脓肿优先抽吸脓液+切取组织送检，开放伤口从深部基底或脓肿边缘采样
• 组织：手术/活检新鲜标本置于无菌生理盐水或专用转运培养基送检，用于培养或核酸检测的标本不可用固定液固定
• 血液：分离培养成人24h内采集3次，每次57ml全血注入专用培养瓶，儿童至少采集1ml；γ-干扰素释放试验采集46ml肝素抗凝静脉血，4h内处理

标本运送和保存

• 总体遵循WS/T 640或制造商建议
• 培养标本：1h内送检，无法及时送检时，血液、脑脊液室温保存不可冷藏/冷冻；胃灌洗液1h内加碳酸钠中和，室温保存；其他标本2℃~8℃保存
• DNA靶标核酸检测标本：2℃~8℃保存不超过10d，-20℃以下冷冻不超过1个月
• RNA靶标核酸检测标本：加RNA保护剂后-20℃以下冷冻保存

标本接收和拒收

• 接收符合WS/T 640通用要求
• 拒收情形包括标本量不足、干燥拭子/肛拭子、含防腐剂的培养标本、未中和的超时胃灌洗液、凝固血液、EDTA抗凝管送检的血培养标本等

标本检测

总则

• 实验室宜同时开展显微镜检查和核酸检测，快速报告结果
• 有条件的实验室可开展培养和鉴定，或外送至有能力的实验室完成培养、鉴定、AST
• 检验方法使用前需按规定完成性能评估，质量控制满足相关标准要求

显微镜检查

• 涂片检查是分枝杆菌感染诊断第一步，操作简便成本低，除血液外所有分枝杆菌培养标本宜先行抗酸染色镜检
• 涂片制备
  • 痰标本挑取异常部分约0.1ml涂片，或液化离心后取沉淀物涂片，痰膜尺寸10mm×20mm，厚度适宜
  • 液体标本3000×g离心15min，取沉淀物涂片
  • 组织标本先研磨再涂片
• 固定：涂片自然干燥后加热固定，酒精灯固定需缓慢过火焰3~4次避免焦化
• 染色方法
  • 萋-尼染色：石碳酸复红加热染色≥5min，3%酸性酒精脱色，亚甲基蓝复染30~60s；油镜下AFB呈红色、背景蓝色，阴性结果需观察≥300个视野；需定期保存涂片，每日开展阴阳性质控
  • 荧光染色：金胺O染色≥15min，0.5%酸性酒精脱色12min，0.5%高锰酸钾复染24min；高倍镜下AFB呈明亮橙黄色荧光，阴性结果需观察≥50个视野；采用LED荧光显微镜，涂片染色后尽快镜检，首次阳性结果需双人复核，每次染色开展阴阳性质控
• 改良Kinyoun染色
  • 操作步骤
    • 染色：滴加Kinyoun石碳酸复红染色液覆盖涂片，室温染色5min，流水冲洗沥干
    • 脱色：滴加1%硫酸水溶液脱色2~3min至无肉眼可见红色，流水冲洗沥干
    • 复染：滴加亚甲基蓝复染30s，流水冲洗沥干
    • 镜检：油镜下AFB呈红色，背景呈蓝色
  • 注意事项
    • 为冷染法无需加热，适用于RGM感染标本染色
    • 染色时间可根据标本类型和室温适当调整
    • 镜检需注意细菌形态，RGM通常较MTBC稍粗短
• 自动制片/阅片
  • 需重视验证检测系统运行过程中AFB的携带污染
  • 操作步骤、结果判断、质量控制等遵循制造商建议
• 结果报告和解释
  • 结果报告
    • 抗酸染色宜在收到标本24h内报告结果
    • 涂片镜检应定量报告，按不同镜检类型对应视野下的菌量标准分级报告
  • 结果解释
    • 抗酸染色敏感度低，痰标本检出限为5000~10000个细菌/ml，不能区分活菌与死菌
    • RGM抗酸性存在差异，荧光染色时可表现为阴性，阴性结果不能排除分枝杆菌感染，疑似病例应行分子检测或培养
    • 奴卡菌属、红球菌属等其他病原体也可表现为抗酸性，宜通过培养、分子生物学方法鉴定菌种
    • 革兰染色出现分枝杆菌染色极弱或不着色、部分RGM呈革兰阳性串珠状杆菌时，宜行抗酸染色或核酸检测
• 检测注意事项
  • 操作步骤遵循制造商建议
  • 临床标本直接涂片抗酸染色宜采用荧光染色，提高检测敏感性和速度
  • 适用时临床标本宜离心浓缩后涂片，提高检测敏感性
  • 胃灌洗液和尿液涂片抗酸染色价值存在争议，粪便涂片很少用于分枝杆菌检测

分离培养和鉴定

总则

• 分离培养是分枝杆菌感染诊断的金标准和治疗监测的必要手段，对少菌MTBC感染、NTM感染的诊断和鉴别诊断价值高
• 疑似分枝杆菌感染患者的标本培养宜同时进行固体和液体培养
• 所有标本培养接种前均需前处理，消化黏液、灭活杂菌、浓缩菌体
• 每批标本处理宜用5~10ml无菌生理盐水或缓冲液做阴性对照，对照阳性则整批结果无效
• 所有培养鉴定的分枝杆菌均应报告，阴性结果不能排除分枝杆菌感染

标本前处理

• 痰、脓液、BALF等黏稠或非无菌标本
  • NaOH消化法：加等体积2%NaOH溶液，涡旋混匀30~60s，室温静置15min后接种
  • NALC-NaOH消化法：加等体积终浓度1%1.5%的NALC-NaOH消化液，涡旋混匀室温静置15min，加PBS至45ml，3000×g离心15min，弃上清后沉淀重悬于12ml PBS备用
• 胃灌洗液：收集于含100mg碳酸钠容器中，3000×g离心15min，弃上清后沉淀重悬于5ml无菌生理盐水，再按非无菌标本方法处理
• 无菌体液：无菌采集的直接3000×g离心15min取沉淀接种，非无菌采集的按非无菌标本方法处理
• 粪便：取1g标本与5ml无菌生理盐水混匀，静置10~15min取上清，再按非无菌标本方法处理
• 组织：无菌采集的研磨成匀浆后直接接种，非无菌采集的研磨后按非无菌标本方法处理

固体培养

• 接种
  • 标本离心沉淀物接种对应培养基：NaOH法处理的接种酸性罗氏培养基，NALC-NaOH法处理的接种中性罗氏培养基
  • 每支培养基至少接种3滴（约0.2ml），使菌液均匀铺展
  • 接种后培养管斜置孵育1~2d待液体吸收，之后直立继续孵育；平皿待液体吸收后密封孵育
• 孵育和观察
  • MTBC最佳孵育温度36℃±1℃，部分分枝杆菌有特殊温度要求，皮肤、骨、关节活检组织宜分别于36℃±1℃和对应低温度双份培养
  • 接种后第3d、第7d及此后每周观察1次，持续8周，部分特殊分枝杆菌需孵育8~12周
  • MTBC菌落通常淡黄色、干燥粗糙、凸起不规则；NTM菌落形态多样，可产色、光滑湿润
  • 培养物抗酸染色阳性后，宜用MPT64快速鉴定或转种PNB鉴别培养基，初步区分MTBC和NTM
• 结果判断
  • 培养8周无分枝杆菌生长，报告培养阴性
  • 确认为分枝杆菌后，报告鉴定结果及菌落丰度，按菌落覆盖斜面面积分级报告

液体培养

• 接种：无污染或经NALC-NaOH法处理的标本离心沉淀物接种专用分枝杆菌液体培养基
• 孵育和培养
  • 培养基置全自动监测系统或手工于36℃±1℃培养，连续培养42d
  • 自动监测系统遵循制造商建议，手工法每日观察培养基浊度或荧光变化
  • 疑似生长时取培养物涂片抗酸染色：阳性无杂菌转种固体培养基；阳性有杂菌重新处理后再接种；阴性无杂菌继续孵育后复检
  • 所有阴性培养基丢弃前需目测检查，疑似生长需涂片镜检
• 结果判断
  • 培养至42d无分枝杆菌生长，报告培养阴性
  • 疑似生长且经鉴定确认为分枝杆菌，报告鉴定结果

菌种鉴定

• 快速抗原鉴定（MPT64检测）
  • 操作要点：取固体培养菌落制备菌悬液或液体培养基上清液，加入检测卡/微孔板，按试剂说明书判断结果
  • 结果报告和解释：阳性提示检出MTBC；阴性提示未检出MTBC，或抗原浓度不足、菌株存在编码基因突变，抗酸染色阳性阴性者需进一步鉴定NTM
  • 注意事项：适用于新鲜培养物MTBC检测，不可直接用于临床标本；部分MTBC菌株可出现假阴性结果
• MALDI-TOF MS法
  • 操作要点：使用新鲜纯培养菌落，充分灭活分枝杆菌，操作遵循制造商建议
  • 结果报告：可报告MTBC或NTM至种/复合群水平，需区分高临床相关性的相似菌种
  • 注意事项：仅适用于纯菌落鉴定，需使用认证的商业化数据库，特殊结果需送有能力的实验室确认
• 核酸鉴定
  • 采用经验证的方法提取核酸，可选用直接测序或间接分析法，根据鉴定需求选择合适靶基因，罕见菌种可采用多靶点联合测序或全基因组测序
  • 结果报告和解释遵循核酸检测相关要求

核酸检测

总则

• 适用于分枝杆菌感染的病原菌及耐药性检测
• 选择检测系统需综合考虑机构条件、人员水平、标本量、人群特征、本地流行状况、方法学性能
• 需快速检测并及时报告结果

标本类型

• 患者标本：呼吸道标本、体液、组织、胃液、粪便等
• 培养物：固体培养基新鲜菌落、液体培养基培养液/沉淀物

检测方法

• 常用技术：以扩增技术为核心的方法、以核酸杂交为核心的方法、各类测序技术
• 临床应用：根据检测系统复杂度不同，对应不同的临床应用场景

分子检测靶标

• 病原菌检测靶标
  • 分枝杆菌通用靶标：16S rRNA基因、ITS、rpoB基因、hsp65基因、IS6110、IS1081序列等
  • MTBC特异性靶标：核心靶标为IS6110、IS1081、mpt64等，RD区基因、esxA、esxB等为补充靶标
• 耐药相关检测靶标：覆盖利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、氟喹诺酮类等各类抗分枝杆菌药物的相关突变基因

结果报告和解释

• 阴性结果：报告未检出对应分枝杆菌核酸和/或耐药相关基因/突变，同时注明不能排除感染和/或耐药
• 阳性结果：报告检出对应分枝杆菌核酸和/或耐药相关基因/突变，明确具体信息
• 可疑结果：建议重新送检或采用其他方法验证
• 宜标注“未检出”“检出”的含义，同时标注检测方法、检出限、检测靶标等信息

注意事项

• 需评估检测结果可靠性，必要时采用其他方法验证
• 仅能检测已知耐药基因突变，存在假阴性风险，不能完全替代表型药敏试验
• 治疗效果不佳或检测结果与临床不符时，宜采用培养等方法验证
• 检测结果需结合患者临床表现、流行病学史及其他检查综合分析

免疫学检测

脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）抗原检测

• 检测方法：常用侧向层析法，检测晨尿或随机尿中结核分枝杆菌LAM抗原
• 适应证
  • HIV阳性成人/儿童有结核症状体征时，可检测尿液LAM辅助诊断活动性结核
  • HIV患者CD4⁺T细胞计数＜200个/μl时，无论有无结核症状，可检测尿液LAM辅助诊断活动性结核
• 注意事项
  • 标本易获取、操作简单，为床旁快速检测方法
  • 不宜用于HIV阴性人群可疑结核诊断
  • 不宜用于CD4⁺T细胞计数＞200个/μl且无结核症状患者的辅助诊断
  • 血液LAM试验敏感性低于尿液LAM试验

IFN-γ释放试验（IGRA）

酶联免疫斑点法（ELISPOT）

• 操作要点
  • 采集4~6ml肝素抗凝外周血，室温4h内分离外周血单个核细胞并计数
  • 取2.5×10⁵细胞加入预包被IFN-γ抗体的96孔板，37℃、5%CO₂孵育16~20h
  • 洗板后加酶标抗体，2℃~8℃孵育1h
  • 洗板后加底物，室温避光反应7min
  • 蒸馏水冲洗终止反应，干燥后读取斑点数
• 结果报告和解释
  • 结果报告为阳性或阴性
  • 阳性提示存在结核特异性致敏T淋巴细胞，机体感染MTB，无法区分活动性/潜伏性结核
  • 阴性提示未检出结核特异性T淋巴细胞，可能未感染MTB，需注意免疫抑制导致的假阴性，不能排除结核感染
• 注意事项
  • 适用于潜伏性结核的诊断和筛查
  • 不可单独用于诊断或排除结核，病原学阴性的可疑结核患者、难以取材的可疑肺外结核患者可用于辅助诊断
  • 病原学阴性的可疑结核性胸膜炎患者，可采集胸腔积液检测
  • 可定量报告斑点数值，但无法区分活动性与潜伏性结核
  • 检测结果受免疫抑制状态影响较小，但免疫抑制患者斑点数值会降低
  • 无标准室内质控方案，需遵照标准化操作规程执行

酶联免疫吸附试验（ELISA）

• 操作要点
  • 新鲜肝素抗凝外周血加入反应管混匀，37℃、5%CO₂孵育16~24h
  • 离心后检测血浆IFN-γ浓度
• 结果报告和解释：同ELISPOT结果解释规则
• 注意事项
  • 不可用IFN-γ浓度区分活动性与潜伏性结核
  • 检测结果受免疫抑制状态影响较大，免疫抑制患者不确定结果比例增高
  • 操作简便，可使用全自动检测仪器，适合潜伏性结核筛查
  • 也可使用化学发光等方法检测IFN-γ浓度

药物敏感性试验

总则

• 分为基于培养的表型检测方法、基于耐药基因的分子检测方法两类
• 表型检测需7~10d或4周，分子方法可直接检测培养物和临床标本，快速出具结果

表型检测

固体培养基法

• 菌液制备
  • 选取生长1~2周、鉴定为分枝杆菌的新鲜菌落
  • 挑取菌落加入含玻璃珠的磨菌管，振荡20~30s，静置15min
  • 加1~2ml无菌生理盐水混匀，静置15min，取上层菌液调整至1麦氏浊度（1mg/ml）
  • 十倍稀释得到10⁻²、10⁻⁴浓度的稀释液
• 接种
  • 分别取10⁻⁴、10⁻²稀释液接种对照培养基和含药培养基
  • 拧紧管盖，37℃竖直培养4周
• 结果报告和解释
  • 按菌落生长情况记录为(-)、(+实际菌落数)、1+、2+、3+、4+
  • 耐药百分比=（含药培养基菌落数/对照培养基菌落数）×100%
  • 耐药百分比＞1%判定为耐药
• 注意事项
  • 对照培养基菌落生长良好，且高稀释度对照菌落数≥20个，试验有效
  • 高低稀释度对照均不可数时，含药培养基菌落数≥20个判定为耐药；高稀释度耐药、低稀释度敏感时试验无效

液体培养基法

微量肉汤稀释法

• 药物选择
  • MTBC：优先检测利福平、异烟肼等8种药物，次选乙胺丁醇等4种药物，部分药物可相互替代；吡嗪酰胺不可用该法检测；难治患者可结合MIC值调整个体化方案
  • RGM：MIC检测宜包含阿米卡星、头孢西丁等10种药物
  • SGM：MIC检测宜包含克拉霉素、利福平等10种药物
• 试剂和菌液制备
  • 选取鉴定为分枝杆菌的新鲜培养物制备菌悬液，调整至0.5麦氏浊度
  • MTBC：稀释得到1×10⁵CFU/ml接种液；NTM：取50μl菌悬液加入对应肉汤备用
• 加样
  • 选择对应药敏板，每孔加100μl菌悬液，密封后36℃±1℃、非CO₂培养箱孵育
• 结果观察和报告
  • MTBC和SGM孵育7d，RGM孵育72h后读取结果
  • 阳性对照孔生长良好时读取含药孔MIC值，甲氧苄啶-磺胺甲噁唑以生长抑制80%的孔为MIC值
  • 有折点标准时判定为敏感/耐药，无折点仅报告MIC值
• 注意事项
  • MTBC：可多次检测MIC监测耐药变化，常规质控菌株为H37Rv ATCC 27294
  • RGM：部分药物MIC超出预期范围需复核并注明提示，常规质控菌株为外来分枝杆菌ATCC 700686
  • SGM：有临床意义的分离株需及时做药敏，MAC单药或联合治疗均可能产生大环内酯类耐药，常规质控菌株为海分枝杆菌ATCC 927等

仪器法

• 菌液制备
  • 液体培养基来源：报阳24h内的培养物可直接接种，孵育3~5d的1:5稀释，超过5d需重新培养
  • 固体培养基来源：取生长1~2周的菌落，调整为0.5麦氏浊度后1:5稀释制成工作菌液
• 药液准备
  • 不同药物按要求加无菌水复溶，分装后-20℃最长保存6个月，仅可冻融1次
  • 培养管先加0.8ml药敏营养添加剂，再加0.1ml对应药液
• 接种
  • 含药培养管加0.5ml工作菌液，SM/INH/RFP/EMB对照管加1:100稀释的工作菌液，PZA对照管加1:10稀释的工作菌液
  • 混匀后上机，仪器自动孵育并报告结果，操作遵循说明书要求
• 结果报告和解释：遵循制造商建议

基因型检测

• 总则：通过检测耐药相关基因突变判定药敏，适用于菌株及各类临床标本，可作为耐药结核快速筛查和辅助诊断方法
• 检测方法：参考对应核酸检测标准

实验诊断

总则

• 诊断原则：快速诊断MTBC，准确鉴定NTM，识别复合/混合感染，检测药物耐药性

推荐意见

• 联合涂片和分子生物学方法，快速鉴别MTBC和NTM
• 高度怀疑MTBC感染但初次检测阴性者，需多次/多部位采样或联合多种方法检测
• 所有MTBC病原学阳性患者需立即开展耐药筛查，优先用分子方法识别耐多药结核，可疑或临床需要时补充培养和表型药敏
• 高度怀疑NTM感染检测阴性者，需再次采集同类型或不同类型标本检测
• NTM检测阳性需结合临床信息判断为感染、定植或污染，NTM病需鉴定至种/亚种，必要时提供药敏结果
• 明确NTM病患者需做表型AST，结合指南和药敏结果制定治疗方案
• 基因型药敏提示敏感但临床治疗无效，排除依从性因素后需做表型AST；快速生长分枝杆菌erm基因阳性者，需在治疗前及第14d分别做表型AST排除大环内酯类诱导耐药
• 免疫学检测（如IGRA）对病原学阴性MTBC感染诊断有补充价值

检验质量保证

总则

• 核心要求：确保结果及时准确，控制生物安全风险
• 管理体系：宜遵循GB/T 22576.1、GB/T 22576.6要求建立，监控检验全过程
• 质量指标设置：需与实验室技术能力适配，覆盖检验前、中、后全过程，建立基线/正常值，明确监测间隔
  • 分析3~6个月数据作为质量指标基线/正常值
  • 每隔1~3个月监测1次，正常情况下结果保持一致或轻微波动
• 异常处理：质量指标显著变化或偏离正常范围时，核查程序并采取纠正措施

常用质量指标

涂片镜检相关

• 抗酸染色阳性率：计算公式为（抗酸染色阳性标本数/抗酸染色标本数）×100%，异常原因包括试剂/水污染、技术问题导致假阳性，设备性能不足、镜检视野/时间不足导致假阴性
• 培养阳性标本的涂片阳性率：评估涂片镜检敏感性，分为MTBC、NTM两类分别计算，异常原因包括患者治疗后涂片阳培养阴、污染、设备/标本问题等
• 涂片阳性标本的培养阳性率：评估涂片镜检特异性，计算公式为（涂片阳性标本中MTBC和NTM培养阳性数/涂片阳性中MTBC和NTM培养标本数）×100%，通常为90%～98%，比例下降原因包括涂片假阳性、患者治疗后培养假阴性
• 抗酸染色报告及时率：计算公式为（目标周转时间内抗酸染色报告数/抗酸染色报告数）×100%，目标周转时间为收到标本后24h

分离培养相关

• 标本污染率：计算公式为（报告为“污染”的标本数/分枝杆菌培养标本数）×100%，通常为3%～5%，异常原因包括标本运送延迟、处理不当、试剂/培养基污染、NaOH浓度异常等
• 含抗微生物药物液体培养基污染率：计算公式为（因污染丢弃的含抗微生物药物液体培养基数/接种的含抗微生物药物液体培养基数）×100%，通常为7%～8%，污染率上升原因为抗微生物药物浓度不足或失效
• 固体培养基污染率：计算公式为（因污染丢弃的固体培养基数/接种的固体培养基数）×100%，通常为2%～5%，异常原因同标本污染率
• MTBC/NTM培养阳性率：分别按对应公式计算，阳性率上升原因为交叉污染、试剂/水污染等，下降原因为仪器、培养基、标本质量问题等
• MTBC培养鉴定及时率：计算公式为（目标TAT内MTBC鉴定数/MTBC培养阳性报告数）×100%，目标TAT为收到标本后21d
• 一线抗结核药物敏感性报告及时率：计算公式为（目标TAT内一线抗结核药物敏感性报告数/一线抗结核药物敏感性报告数）×100%，目标TAT为鉴定为MTBC后17d

核酸检测相关

• 培养确诊结核病患者同时送检MTBC核酸检测比率：适用于开展MTBC培养的实验室，仅纳入初始诊断患者，需建立基线值、制定目标值定期监测，提升比率以缩短诊断时间
• 分枝杆菌NAAT报告及时率：计算公式为（目标TAT内NAAT报告数量/分枝杆菌NAAT报告数量）×100%，目标TAT为标本采集后48h

分枝杆菌感染分子生物学实验诊断常用技术

实时荧光PCR技术

• 原理：反应体系加入荧光基团，实时监测荧光信号定量起始模板，分非特异性、特异性检测两类
• 特点：敏感度高、可定量，可实现高通量、高自动化，全程封闭检测
• 应用：菌种鉴定、耐药性检测

等温扩增技术

• 原理：恒温条件下利用多酶协同扩增靶核酸，实时荧光探针检测
• 特点：简单、快速、特异性高，RNA检测需先逆转录为cDNA
• 应用：结核分枝杆菌RNA/DNA核酸检测

巢式PCR技术

• 原理：两轮连续扩增，先外侧引物预扩增，再内侧引物特异性扩增目标片段
• 特点：二次扩增提升敏感度和特异度
• 应用：菌种鉴定、耐药性检测

多重PCR技术

• 原理：单反应体系加入多对引物，同时扩增多个目标DNA序列
• 特点：多靶标检测，提升病原体检测覆盖范围
• 应用：菌种鉴定、多种耐药突变同时检测

数字PCR技术

• 原理：样品分为大量微小独立反应单元，独立扩增后计数阳性单元，计算目标分子绝对拷贝数
• 特点：可绝对定量，敏感度极高
• 应用：菌种鉴定、耐药性检测，适用于低菌量标本、低频耐药突变检测

逆转录PCR技术

• 原理：以RNA为模板逆转录为cDNA，再进行PCR扩增
• 特点：可放大微量RNA信号
• 应用：结核分枝杆菌RNA检测

基于荧光探针熔解曲线的多重PCR技术

• 原理：实时荧光PCR衍生技术，扩增结束后通过荧光值随温度变化区分扩增产物
• 特点：高特异性，单管完成扩增检测，成本低，可同时鉴定菌种和筛查耐药
• 应用：菌种鉴定、多种耐药突变检测

基因芯片技术

• 原理：基于碱基互补配对核酸杂交，高通量并行检测分析大量基因信息
• 特点：短时间内可同时检测多种耐药性、MTBC及常见分枝杆菌，通量高
• 应用：菌种鉴定、多种耐药突变检测

线性探针技术（LPA）

• 原理：特异性探针固定在膜条上，与标记的标本DNA杂交
• 特点：短时间内可同时检测多种耐药性、结核分枝杆菌复合群，特异性高
• 应用：菌种鉴定、多种耐药基因突变检测

一代测序（Sanger测序）

• 原理：双脱氧核苷酸随机终止DNA链延伸，毛细管电泳分离读取序列
• 特点：准确性极高为金标准，读长可达1000bp，但通量低、成本高，无法检测<20%的低频突变，混合感染标本可能漏检
• 应用：分枝杆菌菌种鉴定、耐药突变确认

全基因组测序技术（WGS）

• 原理：对分枝杆菌全基因组断裂、测序、重组装，与参考基因组比对识别遗传变异
• 特点：可提供全面遗传信息，识别已知/未知耐药突变，仅用于纯培养物检测，价格贵、报告周期长
• 应用：菌种鉴定及耐药谱预测、基因分型与溯源、异质耐药检测，为相关研究金标准

宏基因组二代测序（mNGS）

• 原理：高通量测序直接检测标本中所有微生物核酸，比对数据库识别病原体
• 特点：广谱覆盖病原体，可为混合感染、罕见病原体、疑难感染提供诊断线索；但分枝杆菌检出率受核酸丰度、数据库限制，阴性不能排除感染，需结合其他方法验证，成本高、周期长
• 应用：分枝杆菌合并其他病原体感染诊断，尤其是合并罕见病原体感染

靶向二代测序技术（tNGS）

• 原理：通过PCR或探针捕获富集分枝杆菌耐药、菌种鉴定相关目标区域，再高通量测序
• 特点：检测深度和敏感度高，通量大、数据量小，可定制靶标，成本低于mNGS，操作简便适合大规模临床应用
• 应用：耐药性检测、菌种鉴定

纳米孔测序技术

• 原理：直接测量单分子核酸通过孔道时的电信号变化完成测序
• 特点：超长读长、测序时间短、高通量，可直接测天然核酸序列，敏感度高、便携，但原始错误率高，数据分析复杂
• 应用：菌种鉴定、耐药性检测、病原传播监测和溯源

不同复杂程度核酸检测系统临床应用

低复杂度系统

• 应用场景：基层医院、实验室功能布局少的医疗机构
• 适用标本：常见临床采集标本
• 要求：无需PCR实验室，普通人员经简单培训即可操作
• 操作特点：仅分标本前处理和上机检测，前处理仅需将标本与处理液简单混合，检测过程全封闭
• 结果输出：实时监测，自动输出或肉眼与对照对比即可判读
• 技术类别：等温扩增(DNA)、快速实时荧光定量PCR便携式系统

中等复杂度系统

• 应用场景：实验室布局完善、设置PCR实验室的机构
• 适用标本：常见临床采集标本或纯培养物
• 要求：需生物安全实验室及PCR实验室，人员需经严格系统培训
• 操作特点：分为标本前处理、扩增体系配制、模板混合后上机，前处理需多步骤提取核酸，检测过程可能需开盖操作
• 结果输出：实时监测，自动输出
• 技术类别：多重PCR、等温扩增(RNA)、线性探针技术、基因芯片技术、熔解曲线技术

高等复杂度系统

• 应用场景：实验室布局完善、设置PCR实验室，配备特殊仪器设备及平台的机构
• 适用标本：常见临床采集标本或纯培养物
• 要求：需生物安全实验室及PCR实验室，人员需经培训，对特殊仪器操作、生物信息学分析要求高
• 操作特点：步骤多，文库制备要求高，部分操作需开放进行，前处理需多步骤提取核酸，检测过程可能需开盖操作
• 结果输出：实时监测自动输出，或输出文件后经生物信息学分析获得结果
• 技术类别：数字PCR、巢式PCR、逆转录PCR、测序技术

结核分枝杆菌复合群微量肉汤稀释法推荐检测药物

最高推荐级别药物

• 利福平（RFP）：浓度范围0.016～2mg/L
• 异烟肼（INH）：浓度范围0.016～2mg/L
• 左氧氟沙星（Lfx）：浓度范围0.006～8mg/L
• 贝达喹啉（Bdq）：浓度范围0.0008～1mg/L
• 利奈唑胺（Lzd）：浓度范围0.06～4mg/L
• 氯法齐明（Cfz）：浓度范围0.0008～1mg/L
• 德拉马尼（Dlm）：浓度范围0.002～0.25mg/L

较高推荐级别药物

• 乙胺丁醇（EMB）：浓度范围0.125～8mg/L
• D-环丝氨酸（DCs）：浓度范围1～64mg/L
• 乙硫异烟胺（Eto）：浓度范围0.125～16mg/L

一般推荐级别药物

• 卡那霉素（Km）：浓度范围0.125～16mg/L，已不推荐用于临床治疗，仅用于替代阿米卡星做体外药敏检测